• Harrison Ford trong vai Indiana Jones, một giáo sư khảo cổ học, người thường dấn thân vào những cuộc phiêu lưu đầy nguy hiểm để có được những cổ vật quý hiếm. Jones tuyên bố rằng anh ta không có niềm tin vào siêu nhiên, cho đến khi anh phát hiện ra Chiếc rương thánh tích. Spielberg đề nghị cho Ford vào vai Jones, nhưng Lucas phản đối, nói rằng ông không muốn Ford trở thành "Bobby De Niro" của mình hay "anh chàng mà tôi sẽ đưa vào tất cả các bộ phim của mình", ám chỉ đến sự hợp tác thường xuyên của Martin Scorsese với Robert De Niro.[10] Mong muốn một diễn viên ít được biết đến sẽ thủ vai này, Lucas đã thuyết phục Spielberg giúp ông tìm kiếm một tài năng mới. Trong số các diễn viên đã thử vai có Tim Matheson, Peter Coyote, John Shea và Tom Selleck. Selleck ban đầu dự định sẽ thủ vai Indiana, những ở đã từ chối vì bận đóng bộ phim truyền hình Magnum, PI.[10][11] Vào tháng 6 năm 1980, ba tuần sau khi ghi hình,[12] Spielberg đã thuyết phục thành công Lucas để cho Ford đóng vai này sau khi nhà sản xuất Frank Marshall và Kathleen Kennedy bị ấn tượng bởi vai diễn Han Solo trong Đế chế phản công.
• Karen Allen vai Marion Ravenwood, người yêu cũ của Indiana. Cô là con gái của Abner Ravenwood, cố vấn của Indiana Jones và sở hữu một quán bar ở Nepal. Allen đã được chọn sau khi thử vai cùng với Matheson và John Shea. Spielberg đã để ý đến cô sau khi ông xem bộ phim Animal House có sự tham gia của cô. Sean Young trước đây cũng đã từng thử vai nhân vật này,[10] trong khi Debra Winger thì lại từ chối vai diễn.[13]
• Paul Freeman vai Tiến sĩ René Belloq, đối thủ của Jones. Belloq cũng là một nhà khảo cổ học, nhưng lại làm việc cho Đức quốc xã. Spielberg đã chọn Freeman sau khi đánh giá diễn xuất của anh trong Death of a Princess..[14] Trước khi Freeman được chọn vào vai Belloq, nam diễn viên Giancarlo Giannini ban đầu dự định sẽ thủ vai này,[15] và ca sĩ Jacques Dutronc cũng từng thử vai Belloq, nhưng Freeman mới là người được chọn.
• Ronald Lacey vai Thiếu tá Arnold Toht, một đặc vụ Gestapo tàn bạo, đã tra tấn Marion Ravenwood để lấy chiếc huy hiệu của Quyền trượng Ra. Lacey được chọn vào vai này sau khi anh nhắc với Spielberg về diễn viên Peter Lorre, người chuyên đóng vai những kẻ giết người hàng loạt.[10] Spielberg ban đầu đề nghị giao vai diễn này cho cho Roman Polanski, người rất muốn được làm việc với Spielberg nhưng sau đó anh đã từ chối vì sẽ không thể thực hiện chuyến đi tới Tunisia.[16] Klaus Kinski cũng được mời thủ vai Toht, nhưng anh ghét kịch bản phim,[17] và gọi đó là "tồi tệ về mặt đạo đức".[18] Michael Sheard, người sau đó đóng vai Đại úy Oskar Schomburg, cũng đã thử vai vai diễn này, nhưng bị đánh bại bởi Lacey.[19]
• John Rhys-Davies vai Sallah, được Indiana gọi là "thợ đào giỏi nhất Ai Cập", người đã được Đức quốc xã thuê để giúp họ khai quật Tanis. Anh là một người bạn cũ của Indiana, đã đồng ý giúp anh ta khai quật Chiếc hòm. Spielberg ban đầu đã mời Daniel DeVito đảm nhận vai Sallah, nhưng anh không thể thực hiện được điều đó do xung đột lịch trình. Spielberg đã chọn Rhys-Davies sau khi bộ phim Shōgun có sự tham gia của anh.[10]
• Denholm Elliott vai Tiến sĩ Marcus Brody, người cai quản viện bảo tàng, đã mua những cổ vật từ Indiana để trưng bày trong bảo tàng của mình. Những đặc vụ chính phủ Hoa Kỳ tiếp cận anh vì những thông tin liên quan đến Chiếc hòm giao ước, và Brody đã yêu cầu Indiana Jones gặp họ. Spielberg đã mời Elliott thủ vai Marcus Brody vì ông là một fan hâm mộ lớn của nam diễn viên, người đã từng tham gia vào một số bộ phim mà Spielberg yêu thích.[10]

Ngoài ra, Wolf Kahler tham gia Chiếc rương thánh tích với vai diễn Đại tá Dietrich, một sĩ quan Đức độc ác chỉ huy chiến dịch bảo vệ Chiếc hòm. Alfred Molina, trong bộ phim đầu tay của mình, thủ vai Satipo, một trong những người dẫn đường của Jones xuyên qua rừng rậm Nam Mỹ, trong khi George Harris vào vai Simon Katanga, thuyền trưởng của tàu vận chuyển Bantu. Anthony Higgins xuất hiện trong phim với vai Thiếu tá Gobler, cánh tay phải đắc lực của Đại tá Dietrich và Vic Tablian trong vai Barranca và chú khỉ.

Don Fellows và William Hootkins xuất hiện với vai Đại tá Musgrove và Thiếu tá Eaton, hai đặc vụ Tình báo Quân đội. Nhà sản xuất Frank Marshall đóng vai một phi công trong phân đoạn chiến đấu trên máy bay không đuôi. Do diễn viên đóng thế bị ốm, nên anh ấy đã nhận vai diễn thay thế. Cảnh quay trong ba ngày yêu cầu anh phải ngồi buồng lái nóng nực, mà anh nói đùa là hơn "140 độ".[10] Pat Roach trong vai thợ cơ khí của Đức Quốc xã, người mà Jones đánh nhau trong phân đoạn này, cũng như một người đàn ông Sherpa to lớn chiến đấu với Jones trong quán bar của Marion. Hiếm khi nào Roach vào vai hai nhân vật đều bị giết chết trong một bộ phim.[20] Giám sát viên hiệu ứng đặc biệt Dennis Muren thủ vai một điệp viên Đức Quốc xã trên chiếc thủy phi cơ chở Jones đi từ San Francisco đến Manila. Terry Richards vào vai kiếm sĩ Cairo bị Indiana Jones bắn.